制锁阳具有补肾阳、益精血、润肠通便之功效，临床上用于腰膝酸软，阳痿滑精，长燥便秘[1]。锁阳中所含的熊果酸被认为是指标性成分之一[2]，具有广泛的生物活性，尤其在抗肿瘤[3]、调解免疫力[3]、对抗因化学因素引起的肝、肺、肾及脑的损害等方面具有较好的作用[4]，故选用熊果酸作为含量测定指标成分。中国药典（Ⅰ部）2020年版、甘肃省中药炮制规范(2009年版)对锁阳炮制品种含量测定指标未给予描述，不利于锁阳炮制品种的质量控制。为此，我们开展实验研究，建立锁阳炮制品种-九制锁阳中熊果酸的含量测定方法并制定限度。同时，根据质量控制的需要，保留性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别（TLC）、浸出物、水分与总灰分等项目。本实验研究所建立的九制锁阳质量标准，能控制产品质量，为深入开展九制锁阳质量控制提供依据。
一、材料与方法
岛津LC-20AT高效液相色谱仪(SPD-20A检测器）（岛津中国企业管理有限公司）；色谱柱Agilent HC-C18（150×4.6mm，5ųm）；FA2004型电子分析天平（上海佑科仪器有限公司）;ME55型梅特勒电子天平(0.01mg)(梅特勒-托利多中国);超声波清洗机（KQ-300VD）（昆山市超声仪器有限公司）等。
熊果酸对照品（批号：B21403-20mg，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂均为分析纯。
12批九制锁阳样品来自安徽华善堂中药饮片有限公司。
二、方法与结果
2.1 性状鉴别：对12批九制锁阳样品观察，结果：本品为不规则形或类圆形的片。外表皮棕褐色或棕黑色，粗糙，具明显纵沟及不规则凹陷。切面浅棕色或棕褐色，散在黄色三角状维管束。气微，味咸，微有酒气。
2.2 显微鉴别：取九制锁阳粉碎，得棕褐色粉末。取粉末以稀甘油和水合氯醛制片观察：栓内层细胞淡棕色，表面观呈类方形或类长方形，壁多细波状弯曲，有的表面有纹理。导管黄棕色或近无色，主为网纹导管，也有螺纹导管，有的导管含淡棕色物。棕色块形状不一，略透明，常可见圆孔状腔隙。
2.3 TLC 依据中国药典（Ⅰ部）2015年版[5]进行试验。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显淡紫红色斑点。
2.4浸出物、水分、总灰分测定 照中国药典2015年版四部规定方法对浸出物、水分、总灰分进行测定。12批九制锁阳醇溶性浸出物测定结果见表1
表1 九制锁阳水分、总灰分和浸出物测定结果
样品编号 | 水分（%） | 总灰分（%） | 浸出物（%） | 样品编号 | 水分（%） | 总灰分（%） | 浸出物（%） |
XG01 | 9.4 | 6.8 | 13.4 | ZG01 | 10.5 | 6.9 | 12.8 |
XG02 | 10.3 | 6.5 | 13.8 | ZG02 | 9.8 | 7.2 | 12.4 |
XG03 | 9.8 | 6.7 | 13.1 | ZG03 | 10.2 | 6.7 | 11.5 |
XJ01 | 8.9 | 7.1 | 13.9 | ZJ01 | 9.5 | 7.2 | 13.2 |
XJ02 | 9.2 | 7.6 | 14.3 | ZJ02 | 9.8 | 6.9 | 12.9 |
XJ03 | 9.9 | 7.3 | 13.8 | ZJ03 | 9.4 | 7.4 | 13.3 |
三、熊果酸含量测定
3.1色谱条件 色谱柱Agilent HC-C18（150×4.6mm，5ųm）;流动相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（270:30:0.1:0.05）；流速1.0ml/min；检测波长210nm；柱温20℃;进样量20μl。
3.2对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品9.80mg，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解定容至刻度，摇匀即得母液（浓度：0.98mg/ml）。吸取对照品母液1ml,置10ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀即得对照品溶液（浓度：0.098mg/ml）。
3.3供试品溶液的制备 精密称取样品细粉0.5g,置具塞锥形瓶中，加甲醇25ml,称定重量，超声处理30min，用甲醇补充减失的重量，静置，过滤，取续滤液，用0.45ųm微孔滤膜过滤，即得。
3.4 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液，按照3.1色谱条件，连续进样6针，记录熊果酸色谱峰面积。相对标准偏差（RSD）0.64%。试验结果表明，精密度良好。
3.5 线性关系考察 分别精密吸取熊果酸对照品母液（浓度：0.98mg/ml）0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，置5ml量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得浓度分别为：0.0392mg/ml，0.0784mg/ml，0.1176mg/ml，0.1568mg/ml，0.1960mg/ml，0.2352mg/ml。按照3.1色谱条件测定，记录色谱法面积。标准曲线试验结果见表2。根据结果：以熊果酸量为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y）。进行线性回归，得回归方程：Y = 326988X + 1570.9，r = 0.9999。绘制标准曲线图见图1。
表2 标准曲线试验结果（n=6）
浓度（mg/ml） | 0.0392 | 0.0784 | 0.1176 | 0.1568 | 0.196 | 0.2352 |
熊果酸（ųg） | 0.784 | 1.568 | 2.352 | 3.136 | 3.920 | 4.704 |
峰面积（A) | 257148 | 514376 | 771355 | 1021552 | 1295690 | 1532828 |
图1 熊果酸标准曲线图
3.6 稳定性实验 吸取同一供试品溶液，“3.1色谱条件”，分别于0、2、4、6、8、12h进行测定，以熊果酸峰面积计，相对标准偏差（RSD）为1.24%。试验结果表明，供试品溶液在放置12h内稳定。
3.7 重复性实验 分别精密称取同一批号的九制锁阳粉末0.5g,共6份。按照3.3供试品溶液的制备方法制备供试品溶液和3.1色谱条件测定熊果酸含量。相对标准偏差（RSD）为0.84%。试验结果表明，重复性良好。
3.8加样回收率实验 精密称取与重复性试验考察一致粉末0.5g，共6份（2份加熊果酸对照品0.49mg，2份加熊果酸对照品0.98mg；2份加熊果酸对照品1.47mg），按照3.3供试品溶液的制备方法制备供试品溶液和3.1色谱条件测定熊果酸含量，平均回收率98.7%，相对标准偏差（RSD）为1.04%。结果见表3。结果表明，回收率符合要求。
序号 | 样品熊果酸含量（mg） | 加入对照品量（mg） | 测定量（mg） | 回收率（%） | 平均回收率（%） | RSD% |
1 | 1.647 | 0.490 | 2.106 | 98.6 | 98.7 | 1.04 |
2 | 1.647 | 0.490 | 2.097 | 98.1 | ||
3 | 1.633 | 0.980 | 2.628 | 100.6 | ||
4 | 1.632 | 0.980 | 2.583 | 98.9 | ||
5 | 1.708 | 1.470 | 3.101 | 97.6 | ||
6 | 1.678 | 1.470 | 3.100 | 98.5 |
表3 加样回收率试验测定结果
3.9熊果酸含量测定结果 照“3.3供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与不同批次供试品溶液各20μl，注入色谱仪，对照品和供试品色谱图见图2。按外标法计算每批样品中熊果酸含量，结果见表4。
a 对照品溶液 b 供试品溶液
图2 HPLC 图谱
表4 12批九制锁阳熊果酸测定结果
样品编号 | 含量测定（%） | 样品编号 | 含量测定（%） | 样品编号 | 含量测定（%） | 样品编号 | 含量测定（%） |
XG01 | 0.287 | XJ01 | 0.327 | ZG01 | 0.279 | ZJ01 | 0.325 |
XG02 | 0.285 | XJ02 | 0.338 | ZG02 | 0.276 | ZJ02 | 0.314 |
XG03 | 0.284 | XJ03 | 0.329 | ZG03 | 0.277 | ZJ03 | 0.317 |
四、讨论
4.1 限度 九制锁阳性状颜色明显深于锁阳片达到棕褐色制棕黑色，炮制过程中加入黄酒和盐等辅料，气味均明显发生了改变，故修订为气微，味咸，微有酒气。显微鉴别方面炮制后淀粉粒已发生改变，故去除淀粉显微鉴别。根据中国药典2015版方法测定：水分测定结果：8.9%~ 10.3%；总灰分测定结果：6.5%~ 7.6%；醇溶性浸出物测定结果：13.1%~ 14.3%。测定12批九制锁阳熊果酸含量在0.276%~ 0.338%。根据九制锁阳样品情况确定限度：水分不得超过11.0%；总灰分不得超过8.0%；醇溶性浸出物不少于11.0%；九制锁阳按干燥品计熊果酸不低于0.26%。薄层色谱鉴别保持药典规定不变。
4.2 熊果酸提取与色谱条件优化 锁阳主要含有三萜类化合物，熊果酸为标志性成分之一。本试验对提取方法和提取时间进行筛选优化，结果显示采用超声提取30min，提取较高，故选择该提取方法。本试验分别考察了不同流动相甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（265:35:0.1:0.05）和甲醇-0.1mol/L乙酸铵溶液（85:15）下样品分离情况，最后选择流动相甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（265：35：0.1：0.05）。
九制锁阳质量标准研究尚无报道，本文研究了九制锁阳的质量，初步形成了质量评价体系，可以用于九制锁阳质量控制。
【 附件：郭庆-九制锁阳质量标准研究.docx 】
